Гост iso определение диоксинов в пищевых продуктах. Термины и определения

Г осударственная система санитарно-эпидемиологического
нормирования Р оссийской Ф едерации

О пределение концентраций загрязняющих

Сборник методических указаний
4.1.662-97, 4.1.666-97

Минздрав России
Москва 1997

1. Подготовлены творческим коллективом специалистов в составе: Малышева А.Г. (руководитель), Зиновьева Н.П., Суворова Ю.Б., Растянников Е.Г., Топорова И.Н., Евстигнеева М.А., Жаворонкова Н.А. (НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН), при участии Кучеренко А.И. (Госкомсанэпиднадзор России).

2. Утверждены и введены в действие Первым заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместителем Главного государственного врача Российской Федерации Семеновым С.В. 31 октября 1996 года.

3. Введены впервые.

Определение концентраций загрязняющих
веществ в атмосферном воздухе

Сборник методических указаний
МУК 4.1.591-96 - 4.1.645-96,
4.1.662-97, 4.1.666-97

Область применения

Методические указания по определению концентраций загрязняющих веществ в атмосферном воздухе предназначены для использования в системе госсанэпиднадзора России, при проведении аналитического контроля ведомственными лабораториями предприятий, а также научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля соответствия уровня содержания загрязняющих веществ их гигиеническим нормам - предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочно безопасным уровням воздействия (ОБУВ) - и являются обязательными при осуществлении аналитического контроля атмосферного воздуха.

Включенные в сборник методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ ов 8.010-90 «Методики выполнения измерений», 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ», 17.0.0.02-79 «Охрана природы. Метрологическое обеспечение контроля загрязненности атмосферы, поверхностных вод и почвы. Основные положения», Р 1.5-92 (пункты 7.3). Все методики анализа метрологически аттестованы и обеспечивают определение веществ с нижним пределом обнаружения не выше 0,8 ПДКм.р. и суммарной погрешностью, не превышающей 25 %, с отбором пробы воздуха в течение 20 - 30 мин при определении максимальной разовой концентрации или круглосуточном отборе пробы при определении среднесуточной концентрации.

В сборнике представлены методики контроля атмосферного воздуха за содержанием нормируемых соединений. Методики основаны на использовании физико-химических методов анализа - фотометрии, потенциометрии, тонкослойной хроматографии с различного вида детектированием, ионной хроматографии, газожидкостной, высокоэффективной жидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии. Приведено 55 методик по измерению концентраций 140 загрязняющих веществ на уровне и ниже их гигиенических нормативов в атмосферном воздухе населенных мест. Контролируемые вещества относятся к различным классам соединений: неорганическим веществам, ароматическим углеводородам, спиртам, органическим кислотам, эфирам, альдегидам, азотсодержащим углеводородам, фенолам, меркаптанам.

Методические указания одобрены и рекомендованы Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию «Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение» Госкомсанэпиднадзора России и бюро секции по физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды Проблемной комиссии «Научные основы экологии человека и гигиены окружающей среды».

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания по
хромато-масс-спектрометрическому
определению летучих органических веществ
в атмосферном воздухе

Настоящие методические указания устанавливают методику хромато-масс-спектрометрического количественного химического анализа атмосферного воздуха для определения в нем содержания летучих органических веществ в диапазоне концентраций 0,001 - 0,2 мг/м 3 для стирола, ацетофенона и нафталина и 0,01 - 4,0 мг/м 3 для других веществ.

Физико-химические свойства веществ и их гигиенические нормативы представлены в табл. .

1. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений с погрешностью, не превышающей ±25 %, при доверительной вероятности 0,95.

Таблица 1

Физико-химические свойства веществ и гигиенические нормативы

Мол. масса

Т. кип., °C

Плотн., г/см 3

Масс-спектры

ПДК, мг/м 3

Класс опасн.

43 58 42 27 39 29 26 44

100 33 7 6 4 4 4 4

Этилацетат

43 29 45 61 27 70 42 88

100 21 14 12 11 8 6 5

Метилметакрилат

41 69 39 43 100 56 29 71

100 80 38 36 34 17 15 15

Изобутанол

43 42 33 41 31 27 39 74

100 56 55 51 40 23 13 10

31 56 41 43 27 42 39 74

100 84 61 60 53 32 17 1

Бутилацетат

43 56 41 27 29 73 61 28

100 38 18 15 14 13 12 10

Циклогексанон

55 42 98 41 27 39 69 70

100 26 31 31 30 26 25 21

Ацетофенон

105 77 51 120 43 50 106

78 100 81 30 27 17 13 8 8

Пентаналь

44 58 29 41 57 43 27 39

100 50 41 30 30 28 20 11

Гексаналь

44 56 41 42 57 27 29 71

100 86 74 67 54 41 38 27

Гептаналь

44 43 70 41 55 29 57 27

100 78 71 61 51 44 43 40

Октаналь

43 29 41 44 57 55 56 84

100 91 90 72 63 51 51 46

Нонаналь

43 44 58 57 41 59 72 87

100 99 83 72 60 51 50 41

Деканаль

57 43 41 55 42 44 70 82

100 94 86 83 54 53 50 49

Бензальдегид

77 106 105 51 50 78 52 74

100 93 92 47 28 19 12 9

57 43 41 29 56 27 42 86

100 77 72 54 49 45 40 14

41 56 42 55 43 27 39 84

100 90 73 61 59 57 45 30

41 56 29 55 42 27 39 98

100 87 71 60 53 48 43 17

Циклогексан

56 84 41 55 42 39 69 27

100 73 62 34 29 24 23 23

78 52 51 77 50 39 79 76

100 19 18 15 15 13 7 6

91 92 39 65 63 51 90 93

100 75 15 12 8 8 65

Ксилол (м + п)

91 106 105 77 51 39 92 27

100 63 28 14 14 14 8 8

Ксилол (о)

91 106 105 77 51 39 92 27

100 63 28 14 14 14 8 8

Этилбензол

91 106 51 92 77 65 39 78

100 33 11 8 8 8 8 7

104 103 78 51 77 105 52

50 100 40 30 26 18 9 9 8

Метилстирол

118 117 103 78 77 115 51

100 74 56 35 28 24 24

Изопропилбензол

105 120 77 79 51 106 103

100 26 13 11 11 97

Пропилбензол

91 120 92 65 39 78 51 105

100 23 11 9 7 6 5 4

1-метил-3-этилбензол

105 120 106 91 77 39 79 51

100 31 9 9 9 8 6 6

1-метил-4-этилбензол

105 120 106 91 77 39 79 51

100 31 9 9 9 8 6 6

1-метил-2-этилбензол

105 120 106 91 77 39 79 51

100 31 9 9 9 8 6 6

1,3,5-триметилбензол

105 120 119 77 39 106 91

100 58 15 11 10 9 9

1,2,4-триметилбензол

105 120 119 77 39 106 91

100 58 15 11 10 9 9

1,2,3-триметилбензол

105 120 119 77 39 109 91

100 58 15 11 10 9 9

Бутилбензол

91 92 134 65 105 39 27

100 58 27 10 9 8 6

Нафталин

128 129 127 51 64 126

102 100 10 10 108 6 6

a -Пинен

93 92 91 77 39 79 121

100 29 24 21 19 18 13

68 93 67 39 79 94 136 53

100 55 44 31 23 22 21 20

Сероуглерод

76 32 44 78 77 46

100 20 17 8 1 0,3

Диметил-дисульфид

94 45 79 46 47 15 48 61

100 60 56 36 25 18 13 12

Хлороформ

83 85 47 35 87 49 37 118

100 64 31 15 10 10 5 2

Четыреххлористый углерод

117 119 121 47 82 35 84

100 97 31 29 24 24 16

1,2-дихлорэтан

27 62 49 63 64 98 51 100

100 92 56 31 30 24 18 14

1,1,1-трихлорэтан

97 99 61 117 119 63 101

100 64 48 19 18 16 10

Тетрахлорэтилен

166 164 129 131 168 94 47

100 78 65 62 47 30 26

Хлорбензол

112 77 114 51 50 38 113

100 50 32 16 15 8 7

Примечание : в колонке «Масс-спектры» в верхней строке - масса ионов, в нижней - их относительные погрешности.

2. Метод измерений

Измерение концентрации летучих органических веществ основано на концентрировании их из воздуха на твердый полимерный сорбент, последующей термической десорбции, криогенном фокусировании в капилляре, газохроматографическом разделении на стеклянной капиллярной колонке с идентификацией по масс-спектрам.

Нижний предел измерения углеводородов в анализируемом объеме пробы - 0,006 мкг, кислородсодержащих соединений - 0,009 мкг, галогенсодержащих - 0,01 мкг, серосодержащих - 0,012 мкг.

Определению не мешает присутствие бутана, бутенов, пентана, циклопентана, метилгексанов, метилгептанов и др. летучих органических веществ.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

3.1. Средства измерений

Хромато-масс-спектрометр

ЛКБ-2091

Компьютерная система, обеспечивающая сбор и хранение всех масс-спектров в процессе проведения хроматографического анализа

Газодиффузионный генератор ГПС-3

ГСО в ампулах № № 092-Э22, 092-Э23, 092-Э24, 092-Э27, 092-Э28, 092-Э29, 092-Э31, 092-Э32

Барометр-анероид М-67

ТУ 2504-1797-75

Линейка измерительная

Лупа измерительная

ГОСТ 8309-75

Секундомер СДС пр-1-2-000

ГОСТ 5072-79

Посуда стеклянная лабораторная

Электроаспиратор М-822, погрешность ±10 %

ТУ 64-1-862-77

3.2. Вспомогательные устройства

Стеклянная капиллярная хроматографическая колонка длиной 50 м, внутренним диаметром 0,36 мм, покрытая неподвижной фазой SE-30 с толщиной пленки 0,25 мкм.

Трубчатая электропечь длиной 160 мм и диаметром 13 мм

Сорбционные трубки из молибденового стекла длиной 200 мм и внутренними диаметрами: толстая - 8 мм и тонкая - 5,6 мм

Накидные гайки с прокладками из витона (диаметр отверстия 6,3 мм)

U-образный стеклянный капилляр длиной 140 мм и диаметром 0,7 мм

Толстостенный стеклянный капилляр длиной 200 мм, наружным диаметром 6,3 мм и внутренним диаметром 0,5 мм

Стеклянный сосуд Дьюара высотой 80 мм и внутренним диаметром 25 мм

Цилиндрический контейнер из дюралюминия с навинчивающейся крышкой длиной 250 мм и внутренним диаметром 35 мм

Эксикатор

3.3. Материалы

3.4. Реактивы

Тенакс GC, зернением 0,2 - 0,25 мм фирмы «Alltech Associates», США ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика, с опытом работы на хромато-масс-спектрометре и владеющих техникой эксплуатации генераторов газодиффузионного типа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях согласно ГОСТу 15150-69 при температуре воздуха (20 ± 10) °C, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %;

Выполнение измерений на хромато-масс-спектрометре проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление сорбционных трубок, подготовка хроматографической системы, приготовление градуировочных парогазовых смесей, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

7.1. Приготовление сорбционных трубок

Сорбционную трубку заполняют полимерным сорбентом тенакс, закрывают концы тампонами из стекловаты, помещают в нагретую до 300 °C трубчатую электропечь и выдерживают в токе гелия при скорости 15 см 3 /мин в течение 24 часов. По окончании кондиционирования трубки с заглушенными концами помещают для хранения в промытый и тщательно просушенный эксикатор, на дно которого насыпан слой сухого силикагеля КСК, а по бокам расположены марлевые мешочки с активированным углем.

7.2. Подготовка хроматографической системы

На крышке термостата газового хроматографа устанавливают штатив с вертикально закрепленной на нем трубчатой электропечью, внутри которой помещают толстостенный стеклянный капилляр, к которому подводят газ-носитель гелий. Выход капилляра, с помощью накидных гаек с прокладками из витона, соединяют с U -образным стеклянным капилляром, который, в свою очередь, подсоединяют непосредственно к стеклянной капиллярной хроматографической колонке. После того, как газовая линия хроматографической системы проверена на отсутствие утечек гелия, закрывают дверцу термостата хроматографа и проводят кондиционирование хроматографической колонки в токе гелия, поднимая температуру термостата со скоростью 6 град/мин до 250 °C. Колонку выдерживают при этой температуре в течение суток. После охлаждения термостата хроматографа до комнатной температуры выход колонки подсоединяют к молекулярному сепаратору масс-спектрометра и записывают нулевую линию. При отсутствии заметных флуктуации система готова к работе.

Градуировочную характеристику устанавливают на градуировочных паровоздушных смесях бензола (толуола), получаемых на газодиффузионном генераторе ПГС-3. Она выражает зависимость площади пика бензола (безразмернные компьютерные единицы) от массы соединения (мкг) и строится по 4 сериям концентраций в диапазоне 0,01 - 0,5 мкг в пробе. Каждая точка градуировочного графика является результатом не менее 4-х измерений одной и той же концентрации. Выходящий из генератора паровоздушный поток объемом 50 см 3 отбирают на тонкую трубку с тенаксом. Объемная скорость воздуха определяется производительностью ампулы с ГСО (мкг/мин), указанной в сертификате на ГСО, и создаваемой концентрацией. Для количественного определения других летучих органических соединений в воздухе рассчитывают их градуировочные поправочные коэффициенты по отношению к бензолу (толуолу), показывающие во сколько раз сигнал детектора полного ионного тока масс-спектрометра, отнесенный к единице массы бензола (толуола), отличается от сигнала детектора на единицу массы соединения (выбранные в качестве опорных веществ бензол или толуол всегда присутствуют в воздухе). При отсутствии стандартных образцов идентифицированных соединений градуировочные поправочные коэффициенты определяют с помощью их эталонов (не менее 98 %). Для этого в условиях хроматографического анализа в прибор вводят микрошприцем, предварительно нагретым до 60 - 70 °C, одинаковые объемы насыщенных паров бензола (толуола) и эталонов анализируемых веществ. Массовое количество m (мкг), содержащееся в объеме V (мм 3) паровоздушной пробы вещества, определяют по формуле:

где

Р - давление насыщенного пара вещества при температуре отбора, мм рт. ст.;

М - молекулярная масса соединения;

V - объем воздушной пробы, мм 3 ;

Градуировку детектора полного ионного тока хромато-масс-спектрометра проводят при следующих условиях:

температура хроматографической колонки

в течение 5 минут комнатная, а затем программируемая до 240 °C со скоростью 6 °C/мин

температура термодесорбции

280 - 300 °C

расход газа-носителя

1,6 см 3 /мин

шкала усилителя детектора полного ионного тока

2 В

ионизирующее напряжение в момент записи хроматографа

25 эВ

ионизирующее напряжение в момент записи масс-спектра

70 эВ

ток эмиссии

50 мкА

ускоряющее напряжение

3500 В

температура ионного источника

270 °C

температура сепаратора

200 °C

диапазон сканируемых масс

25 - 236 а. е. м. (ат. ед. массы)

скорость сканирования магнитного поля магнита

250 масс/сек

Находящийся внутри термостата и соединенный с хроматографической колонкой U-образный стеклянный капилляр погружают в сосуд Дьюара с жидким азотом. Затем, ослабив обжимные гайки, из холодной электропечи вынимают постоянно находящийся в ней толстостенный стеклянный капилляр и вместо него в направлении, обратном пробоотбору, герметично закрепляют сорбционную трубку. В пространство между наружной стенкой сорбционной трубки и внутренней стенкой электропечи помещают термопару от испарителя хроматографа для контроля за температурой термодесорбции. Через 2 - 3 минуты после вытеснения воздуха из сорбционной трубки включают электропечь, которая постепенно (за 8 - 10 мин) нагревается от комнатной температуры до 300 °C. Эту температуру выдерживают еще 1 - 2 минуты, затем нагрев отключают. В течение этого времени газ-носитель полностью освобождает трубку от сконцентрированного в ней вещества и переносит его в U-образный замороженный капилляр. По завершении термодесорбции и криогенного фокусирования жидкий азот убирают и U-образный капилляр на 10 - 15 секунд погружают в стаканчик с налитой в него кипящей водой, в результате чего вещество поступает в капиллярную хроматографическую колонку. После появления хроматографического пика нагрев термостата хроматографа отключают, охлаждают хроматографическую колонку до комнатной температуры и извлекают охлажденную сорбционную трубку из электропечи, вставляя вместо нее толстостенный стеклянный капилляр. Градуировку проверяют 1 раз в полгода, либо сразу после ремонта хромато-масс-спектрометра или генератора ГПС-3.

7.4. Отбор проб

Отбор проб воздуха проводят согласно ГОСТу 17.2.3.01-86 . Отбор проб воздуха осуществляют на толстые сорбционные трубки. Для этого через трубку с помощью аспиратора прокачивают 6 дм 3 воздуха со скоростью 0,2 дм 3 /мин. На трубке обозначают стрелкой направление пробоотбора, а также фиксируют температуру воздушной среды и атмосферное давление. Трубки заглушают пробками из фторопласта и помещают в металлический контейнер, предназначенный для транспортирования. Срок хранения пробы при +4 °C - не более 2 недель.

8. Выполнение измерений

Перед тем, как проводить анализ на хромато-масс-спектрометре, пробу с толстой сорбционной трубки переводят на тонкую трубку, для чего подсоединяют их друг к другу, помещают первую трубку в предварительно нагретую до 280 - 300 °C и расположенную вне прибора электропечь и в течение 10 минут пропускают через них гелий со скоростью 10 см 3 /мин. После этого тонкую трубку отсоединяют от толстой и проводят с ней операции, описанные в п. . Из массива масс-спектров, записанных компьютером в процессе магнитного сканирования, формируют хроматограмму полного ионного тока, по которой проводят идентификацию обнаруженных соединений. Идентификация состоит в сравнении записанных масс-спектров со стандартными (см. табл.) Для подтверждения масс-спектро-метрической информации при идентификации ароматических соединений используют также индексы удерживания этих веществ на неполярной фазе.

9. Обработка результатов измерений

Количественную оценку каждого идентифицированного вещества проводят после компьютерного интегрирования хроматограммы полного ионного тока. На хроматограмме в первую очередь находят пик бензола (толуола) и определяют его концентрацию в атмосферном воздухе (мг/м 3) по формуле:

где

m - масса бензола в пробе, найденная по градуировочной характеристике, мкг;

V 0 - объем отобранного воздуха, приведенный к нормальным условиям, дм 3 ;

где

V t - объем воздуха, отобранный для анализа, дм 3 ;

Р - атмосферное давление в месте отбора пробы, мм рт. ст.;

t - температура воздуха в месте отбора пробы, °C.

Концентрации остальных веществ рассчитывают умножением концентрации бензола на соответствующий градуировочный поправочный коэффициент.

Методические указания разработаны А.Г. Малышевой и Е.Г. Растянниковым (НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН, г. Москва).


стр. 1



стр. 2



стр. 3



стр. 4



стр. 5



стр. 6



стр. 7



стр. 8



стр. 9



стр. 10



стр. 11



стр. 12



стр. 13



стр. 14



стр. 15



стр. 16



стр. 17



стр. 18



стр. 19



стр. 20



стр. 21



стр. 22



стр. 23



стр. 24



стр. 25



стр. 26



стр. 27



стр. 28

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Издание официальное

Стандартинформ

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. № 51-2012)

Краткое наименование страны по МК(ИСО 3166)004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

Г осстандарт Республики Казахстан

Кыргызстан

Кыргызстандарт

Молдова-Стандарт

Российская Федерация

Росстандарт

Узбекистан

Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. № 1424-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31694-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 июля 2013 г.

5 Стандарт подготовлен на основе ГОСТ Р 53601-2009

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты».

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты»

© Стандартинформ, 2013

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Для приготовления буферного раствора смешивают в соотношении 60:40 растворы лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, полученные по 6.3.1 и 6.3.2, добавляют 37,2 г трилона Б, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 4,0 ортофосфорной кислотой.

6.3.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

6.3.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 приливают деионизованную воду, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой.

6.3.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 приливают метиловый спирт, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки метиловым спиртом.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.5 Приготовление градуировочных растворов

6.3.5.1 Приготовление градуировочных растворов тетрацикпинов

Для приготовления градуировочных растворов тетрацикпинов на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают по 10 мг каждого стандартного образца по 4.1 (кроме демеклоцикпина) и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 . Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин и доводят полученный раствор до метки метанолом.

Массовая концентрация каждого антибиотика тетрациклиновой группы в растворе С 0 составляет 1 мг/см 3

Срок хранения раствора -3 мес при температуре минус 20 °С.

6.3.5.2 Приготовление раствора демеклоцикпина (внутреннего стандарта)

Для приготовления раствора внутреннего стандарта на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают 10 мг стандарта демеклоцикпина гидрохлорида и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 . Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, доводят полученный раствор до метки метанолом.

Массовая концентрация внутреннего стандарта в растворе составляет 1 мг/см 3 . Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта до значения 1 мкг/см 3 Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Срок хранения раствора -3 мес при температуре минус 20 °С. 1

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре, в темном месте, не менее 20 мин.

6.4 Хроматографические условия измерений

6.4.1 Хромато-масс-спектрометр включают и настраивают в соответствии с техническим руководством по его эксплуатации и устанавливают следующие хроматографические параметры:

Скорость потока элюента - 200 мм 3 /мин;

Объем вводимой пробы - 20 мм 3 .

6.4.2 Детектирование пиков проводится методом «регистрации выбранных реакций » 1) . Для каждого антибиотика тетрациклиновой группы измеряется сигнал для двух фрагментных ионов согласно таблице 1.

Более интенсивный пик (верхний в каждой строке таблицы 1) служит для определения концентрации антибиотика, второй (нижний в каждой строке таблицы 1) используется для подтверждения правильности определения. Пики ионов-фрагментов с массой 410,1 тетрациклина и доксицикпина различаются по времени их удержания в хроматографической колонке, определяемому на стадии разработки ВЭЖХ-МС/МС метода.

6.5 Построение градуировочной характеристики

6.5.1 Градуировочную кривую строят при помощи матричной градуировки. Для этого проводят обработку «чистых» проб, приготовленных и проанализированных ранее в соответствии с требованиями раздела 7, не содержащих тетра-циклинов более 1 мкг/кг для каждого из антибиотиков, в зависимости от типа исследуемой матрицы. На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в мерную пробирку вместимостью 5 см 3 , содержащую исследуемую «чистую» пробу, добавляют градуировочный раствор тетрациклинов по 6.3.5.1 с таким расчетом, чтобы окончательные массовые концентрации находились в пределах от 1 до 1000 нг/см 3 . Затем добавляют 50 мм 3 раствора внутреннего стандарта по

6.3.5.2 и необходимое количество мобильной фазы А по 6.3.4.1, доводя объем до 1 см 3 .

6.5.2 Для получения градуировочных данных используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.

6.5.3 При построении градуировочной зависимости для количественного определения тетрациклинов анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в 6.2 и 6.4. Затем строят графики зависимости массовой концентрации антибиотика тетрациклиновой группы от отношения площади хроматографического пика антибиотика тетрациклиновой группы к площади пика внутреннего стандарта для каждого фрагментного иона четырех антибиотиков тетрациклиновой группы. Образец графика приведен в приложении Б.

Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи программы Excel (Microsoft Office).

6.5.4 Расчетные концентрации для обоих фрагментных ионов каждого антибиотика тетрациклиновой группы должны совпадать в пределах 20 %.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой каждого фрагментного иона каждого антибиотика тетрациклиновой группы не менее 0,98.

6.6 Подготовка лабораторной посуды и реактивов

6.6.1 Мойку и сушку посуды следует проводить в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Не допускается проведение подготовки посуды в данном помещении для других видов анализов. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы. 2

6.6.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).

6.6.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 °С до 110 °С.

7 Порядок выполнения измерений

7.1 Обработка проб органов, тканей животных, яиц, яичного порошка, молока, молочных продуктов и меда

7.1.1 Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Яйца отделяют от скорлупы. Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1,0 г гомогенизированной пробы в виале на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В виалу добавляют 50 мм 3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 10 см 3 экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Процедуру экстракции и центрифугирования повторяют еще один раз. Объединенные экстракты собирают в чистые виалы.

7.1.2 1,0 г меда взвешивают на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г в виале вместимостью 50 см 3 . В виалу добавляют 50 мм 3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 20 см 3 экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 1 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин.

7.2 Проведение твердофазной экстракции и подготовка к хроматографированию

7.2.1 Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ заполняют 0,5 г сорбента. Предварительно картридж кондиционируют 6 см 3 метилового спирта и уравновешивают 6 см 3 бидистиллированной воды. Затем наносят объединенный экстракт и вновь промывают 6 см 3 бидистиллированной воды. Тетра-

циклины элюируют с сорбента при помощи 6 см 3 мобильной фазы Б. Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле в токе воздуха до 0,5 см 3 при температуре 40 °С.

7.2.2 Для перерастворения и подготовки к хроматографированию объем полученного упаренного элюата в мерной пробирке вместимостью 10 см 3 доводят до 1 см 3 при помощи мобильной фазы А и помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Полученный экстракт фильтруют через мембранный фильтр и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

7.3 Обработка проб молока

7.3.1 Для очистки образцов к навеске образца молока массой 1 г, помещенной в виалу, добавляют 100 мм 3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин, затем оставляют на 15 мин в горизонтальном положении для последующего уравновешивания. Далее виалу с образцом помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Полученный раствор переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 и упаривают до 1 см 3 на нагревательном модуле в токе воздуха при температуре 40 °С. К полученному остатку добавляют 9 см 3 буферного раствора 6.3.3 и помещают на ультразвуковую баню.

7.3.2 Процедуру твердофазной экстракции осуществляют в соответствии с

7.2.1, а перерастворение и подготовку к хроматографированию - в соответствии с

7.4 ВЭЖХ-МС/МС анализ

7.4.1 Для определения остаточного содержания тетрациклинов и их эпиформ проводят анализ в условиях, указанных в 6.4.

7.4.2 Время удерживания антибиотиков тетрациклиновой группы определяют при анализе градуировочных растворов.

7.5 Контроль качества измерений

7.5.1 Каждая серия измерений включает в себя несколько степеней подтверждения качества измерений.

7.5.2 Для исключения контаминации образца используемыми реагентами проводят обработку «чистого образца» в соответствии с 7.1 - 7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.

7.5.3 Для учета матричного эффекта при расчете остаточных содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы используют матричную градуировку по 6.5.

7.5.4 Проводят испытание образца с обработкой пробы в соответствии 7.1 -7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.

7.6 Обработка результатов хроматографического анализа

7.6.1 Расчеты содержания антибиотика тетрациклиновой группы выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров поставляемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем, для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием (приложение Б).

7.6.2 Окончательные результаты измерений содержания тетрациклинов округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.

8 Метрологические характеристики

8.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания тетрациклинов с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к = 2, указанной в таблице 2.

Примечание - Значения относительной расширенной неопределенности, указанные в таблице 2, соответствуют границам относительной погрешности результатов измерений при Р = 0,95.

Таблица 2 - Значения относительной расширенной неопределенности измерений (при коэффициенте охвата к = 2) V, %, в диапазонах измерений содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы, мкг/кг

Антибиотик

тетрациклиновой

Относительная расширенная неопределенность V n , %, при Р = 0,95 и диапазоне измерений содержания тетрациклинов, мкг/кг

от 1,0 до 10,0 включ.

св. 10,0 до 100,0 включ.

св. 100,0 до 1000,0 включ.

Тетрациклин

Окситетрациклин

Доксициклин

Хлортетрациклин

9 Оформление результатов измерений

9.1 Результат анализа М с в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде формулы

м с =х П " С ±и П:С, (1)

где Хп,с- среднеарифметическое значение двух параллельных измерений содержания л-го антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг;

±U n,c - расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к = 2 определения содержания л-го антибиотика тетрациклиновой группы, определяемая по формуле (2), мкг/кг.




9.2 Значения расширенной неопределенности измерения рассчитывают с использованием значений относительной расширенной неопределенности при к = 2 (в соответствии с таблицей 2) по формуле

где Хп,с - среднеарифметическое значение двух параллельных измерений содержания л-го антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг;

V„ - значение относительной расширенной неопределенности содержания л-го антибиотика тетрациклиновой группы для соответствующего диапазона измерений (таблица 2).

10 Контроль качества результатов измерений

10.1 Контроль полноты извлечения внутреннего стандарта тетрацик-линов

10.1.1 Контроль извлечения внутреннего стандарта тетрациклинов выполняют в ходе каждого измерения (получения результата количественного химического анализа при соблюдении требований настоящего стандарта).

10.1.2 Рассчитанные программным обеспечением значения извлечения внутренних стандартов должны находиться в диапазоне от 40 % до 130 %. Если рассчитанное значение извлечения ниже или выше указанного диапазона, то результаты измерения массовой доли тетрациклинов не принимают за окончательный результат. Проводят повторные исследования анализируемых проб.

10.2 Контроль неопределенности результатов измерений

7.3) проводить анализ градуировочных растворов в соответствии с 6.4. Результаты измерений признают удовлетворительными при выполнении следующего неравенства:




Приложение Б (справочное)


Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта


МКС 67.050, 67.100, 67.120

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрацикпиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Food products, food raw materials.

Method of determination of the antibiotic residues of tetracycline group by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

Дата введения - 2013 - 07 - 01

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод идентификации и количественного определения остаточного содержания антибиотиков тетрацикпиновой группы в молоке, молочной продукции, яйцах, яичном порошке, меде, органах и тканях животных с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 1,0 до 1000,0 мкг/кг.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

3.2 Количественное определение остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы проводят методом внутреннего стандарта по сумме площадей пиков идентифицированных соединений и их эпи-форм для каждого антибиотика при помощи градуировочной кривой.

3.3 Детектирование анализируемых проб проводят в режиме регистрации выбранных реакций.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

4.1 При определении содержания антибиотиков тетрациклиновой группы применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

Масс-спектрометр с диапазоном измерения от 100 до 500 атомных единиц массы (а.е.м.), массовым разрешением не менее 500, точностью измерения массы не ниже 0,2 а.е.м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);

Систему высокоэффективную жидкостную хроматографическую, состоящую из бинарного насоса со смесителем; термостата хроматографической колонки, обеспечивающего температуру нагрева до 50 °С;

Компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов масс-спектрометрических измерений;

Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227 ;

Колбы мерные стеклянные К-2-100-2, К-2-1000-2 по ГОСТ 1770 ;

Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см 4 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками ;

Фильтры мембранные с размером пор не более 0,5 мкм ;

Измельчитель-гомогенизатор лабораторный ;

Встряхиватель вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин ;

Центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения ротора не менее 10000 об/с и диапазоном температур охлаждения от 4 °С до 20 °С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см 3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см 3 ;

Модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40 °С ;

Баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм 3 ;

Колонку хроматографическую обращенно-фазную длиной не менее 50 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм;

Устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

Картридж для твердофазной экстракции объемом не менее 12 см 3 , заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм;

Камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 18 °С до минус 24 °С;

Холодильник бытовой с морозильной камерой, цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °С до 5 °С.

4.2 При определении содержания антибиотиков тетрацикпиновой группы применяют следующие реактивы:

Кислоту лимонную пищевую по ГОСТ 908 , высшего сорта;

Метанол х.ч.;

Ацетонитрил ч.д.а.;

Деионизованную воду;

Муравьиную кислоту ч.д.а по ГОСТ 5848 ;

Натрий фосфорнокислый двузамещенный дигидрат ч.д.а по ГОСТ 245 ;ГОСТ 13867 .

5 Требования безопасности

5.1 Используемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности по ГОСТ 12.1.007 , при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 .

5.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

5.3 Операции по приготовлению и дозированию градуировочных растворов следует проводить под тягой в вытяжном шкафу.

5.4 В связи с тем, что при работе на хромато-масс-спектрометре используется сжатый азот, следует соблюдать требования ГОСТ 12.2.085 и правил устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением, действующих на территории государства, принявшего стандарт.

5.5 При выполнении измерений на хромато-масс-спектрометре следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.6 К выполнению измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации аппаратуры.

6 Порядок подготовки к проведению измерений

6.1 Отбор проб

6.1.1 Отбор проб проводят в соответствии с методическими указаниями по отбору проб пищевой продукции с целью лабораторного контроля качества и безопасности, утвержденными на территории государства, принявшего стандарт.

6.1.2 Отбор проб органов, тканей животных и птицы производят в соответствии с . Масса средней пробы органов, тканей животных и птицы не менее 200 г.

6.1.3 Отбор проб молока и молочных продуктов производят в соответствии с ГОСТ 3622 . Объем средней пробы молока не менее 200 см 3 , масса средней пробы образцов молочных продуктов не менее 250 г.

6.1.4 Отбор проб меда производят в соответствии с ГОСТ 19792 . Масса средней пробы меда не менее 200 г.

6.1.5 Отбор проб яиц и яичного порошка производят в соответствии с ГОСТ 31654 и ГОСТ 30364.0 . От яиц в качестве средней пробы отбирают не менее 12 шт.; масса средней пробы яичного порошка не менее 200 г.

6.2 Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы к выполнению измерений

Подготовку хромато-масс-спектрометра к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора.

При этом должны быть соблюдены следующие условия:

Температура окружающего воздуха..............................от 20 °С до 25 °С;

Атмосферное давление.............................................от 84 до 106 кПа;

Напряжение в электросети.........................................(220 + 10) В;

Частота тока в электросети.........................................от 49 до 51 Гц;

Относительная влажность воздуха...............................от 40 % до 80 %.

6.3 Приготовление растворов

6.3.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 21 г лимонной кислоты, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.2 Приготовление раствора гидрофосфата натрия молярной концентрации 0,2 моль/ дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 35,6 г двузамещенного фосфата натрия, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.3 Приготовление буферного раствора 6

^ «Регистрация выбранных реакций» - режим работы масс-спектрометра, при котором детектируется ионный ток только для выбранных фрагментных ионов выбранных ионов-прекурсоров.

ГОСТ 33490-2015

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ

Обнаружение растительных масел и жиров на растительной основе методом газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Milk and milk products. Detection of vegetable fat by gas chromatography with mass spectrometric detection


МКС 67.100.10

Дата введения 2016-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным бюджетным учреждением Ярославской области "Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов" (ГБУ ЯО "ЯГИКСПП")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Киргизия

Кыргызстандарт

Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 01 декабря 2015 г. N 2092-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33490-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочную продукцию и устанавливает качественный метод обнаружения в их составе растительных масел и жиров на растительной основе методом газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
_______________
ГОСТ Р 12.1.019-2009 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".


ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания.

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4165-78 Реактивы. Медь сернокислая 5-водная. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003* Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
_______________
В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".


ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20010-93 Перчатки резиновые технические. Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28165-89 Приборы и аппараты лабораторные из стекла. Аквадистилляторы. Испарители. Установки ректификационные. Общие технические требования

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины и определения в соответствии с , а также термины:

3.1 газожидкостная хроматография: Метод разделения и анализа смеси веществ, основанный на их различных температурах кипения и взаимодействии с неподвижной жидкой фазой в потоке газа-носителя

3.2 масс-спектрометрия: Метод, основанный на разделении ионизированных атомов, молекул и радикалов в газовой фазе, характеризующихся разным отношением массы частицы к ее заряду (m/z), и регистрации спектра образовавшихся ионов.

4 Сущность метода

Метод основан на предварительном гидролизе стероидов, содержащихся в жировой фазе молока и молочных продуктов, в стерины, хроматографическом их разделении газовой хроматографией и сравнении полученных масс-спектров стеринов со спектрами и временем удерживания стандартных веществ.

5 Отбор проб

Отбор и подготовка проб к анализу - по ГОСТ 13928 , ГОСТ 26809.1 , ГОСТ 26809.2 .

Перед анализами отобранные пробы молока и молочных продуктов, за исключением молочных консервов и молочных продуктов в запаянных или закатанных банках, хранят при температуре (4±2)°С, пробы мороженого - при температуре не выше 2°С.

6 Условия проведения анализа

При выполнении анализа в лаборатории следует соблюдать следующие условия:

температура окружающего воздуха

относительная влажность воздуха

атмосферное давление

(95±10) кПа.

7 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Хроматограф газовый, оснащенный масс-спектрометрическим детектором, позволяющим проводить измерения в диапазоне масс от 15 до 500 а.е.м. в режиме ионизации электронным ударом при энергии электронов 70 эВ, масс-спектральном разрешении не менее 1 а.е.м. по всей шкале масс, и программным обеспечением для сбора и обработки данных.

Колонка капиллярная с неполярной неподвижной фазой и верхней температурной границей рабочего диапазона не менее 320°С. Длина и диаметр газохроматографической колонки, толщина слоя неподвижной фазы должны обеспечивать приемлемое хроматографическое разрешение и число теоретических тарелок для полного разделения стеринов.

Термометр ртутный стеклянный лабораторный типа Б по ГОСТ 28498 , с диапазоном измерения температуры от 0°С до 100°С, с ценой деления шкалы 1°С.

Весы по ГОСТ OIML R 76-1 , обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности ±0,0005 г.

Микрошприц вместимостью 10 мм с погрешностью дозирования не более 5%.

Шкаф сушильный лабораторный любого типа по ГОСТ 14919 , поддерживающий температуру до 200°С с погрешностью ±5°С.

Печь муфельная, обеспечивающая нагрев в диапазоне температур от 300°С до 800°С.

Баня водяная с регулируемым обогревом с погрешностью поддержания температуры ±2°С.

Центрифуга лабораторная с ротором для центрифужных пробирок вместимостью 15 и 50 см, обеспечивающая фактор центрифугирования не менее 5000 g .

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919 с закрытой спиралью и регулятором нагревания.

Устройство перемешивающее лабораторное.

Испаритель роторный по ГОСТ 28165 .

Воронки делительные ВД-3-250ХС по ГОСТ 25336 с фторопластовым краном.

Колба коническая Кн-1-100-29/32 ТС, Кн-1-250-29/32 ТС по ГОСТ 25336 .

Колбы круглодонные К-1-50-29/32, К-1-100-29/32, К-1-250-29/32 по ГОСТ 25336 .

Колбы мерные с притертыми пробками 2-5-2, 2-100-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 .

Цилиндры 2-25, 2-50 по ГОСТ 1770 .

Стаканы В-1-50, В-1-100, В-1-1000 по ГОСТ 25336 .

Воронки В-56-80, В-75-110 по ГОСТ 25336 .

Пипетки 1-2-2-1, 1-2-2-10 по ГОСТ 29227 .

Холодильник ХШ-1-300-19/26ХС по ГОСТ 25336 .

Ступка 5 по ГОСТ 9147 .

Пестик 1 по ГОСТ 9147 .

Эксикатор 2-190 по ГОСТ 25336 .

Груша резиновая медицинская.

Палочки стеклянные оплавленные по ГОСТ 21400 .

Щипцы металлические тигельные.

Терка мелкая металлическая.

Пробирки центрифужные вместимостью 15 и 50 см.

Емкости стеклянные (виалы) для жидких проб вместимостью 2 см, снабженные крышками с силиконовой и тефлоновой мембраной.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 .

Бумага индикаторная универсальная для определения рН.

Натрия сульфат по ГОСТ 4166 , безводный.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328 , х.ч.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 .

Медь (II) сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165 , х.ч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .

Кислота серная по ГОСТ 4204 , х.ч.

Калий двухромовокислый по ГОСТ 4220 , х.ч.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363 , ч.д.а.

Метанол с массовой долей основного вещества не менее 99,8%.

Тетрагидрофуран с массовой долей основного вещества не менее 99,5%.

Гелий газообразный марки А (объемная доля гелия не менее 99,995%).

Холестерин с массовой долей основного вещества не менее 99,0% (CAS N 80-99-9).

Смесь фитостеринов - брассикастерин (CAS N 474-67-9), кампестерин (CAS N 474-62-4), стигмастерин (CAS N 83-48-7), -ситостерин (CAS N 83-46-5) - в хлороформе суммарной массовой концентрации 25 мг/ см.

Допускается применение других средств измерения и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

8 Подготовка к проведению анализа

8.1 Подготовка посуды

Стеклянную химическую посуду, используемую в процессе анализа, ополаскивают водопроводной водой, заливают хромовой смесью до 1/4-1/3 вместимости сосуда и осторожно смачивают внутренние его стенки. После этого хромовую смесь выливают обратно в емкость для хранения. Посуду оставляют на несколько минут, затем тщательно отмывают сначала водопроводной, а затем дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при температуре 105°С.

8.2 Подготовка реактивов и материалов, приготовление растворов

8.2.1 Натрий сернокислый безводный прокаливают в муфельной печи 4 ч при температуре 400°С и охлаждают в эксикаторе.

Срок хранения натрия сернокислого безводного в эксикаторе при комнатной температуре - не более 3 мес.

8.2.2 Осадительный реактив

В химическом стакане вместимостью 500 см взвешивают (70,0±0,1) г сернокислой меди и растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

Срок хранения осадительного реактива в склянке из темного стекла при комнатной температуре - не более 3 мес.

8.2.3 Раствор гидроксида калия в метаноле молярной концентрации 2 моль/дм

В мерной колбе вместимостью 100 см взвешивают (11,21±0,01) г предварительно измельченного гидроксида калия и доводят объем раствора до метки метанолом, интенсивно перемешивают до полного растворения гидроксида калия и дают остыть до комнатной температуры.

Срок хранения раствора в плотно закрытой склянке при температуре (4±2)°С - не более 3 мес.

8.2.4 Стандартный раствор холестерина массовой концентрации 5 мг/см

В химическом стакане вместимостью 100 см взвешивают (0,50±0,01) г холестерина, вносят около 50 смн -гексана, аккуратно перемешивают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем раствора н -гексаном до метки.


8.2.5 Раствор смеси фитостеринов суммарной концентрации 5 мг/см

В мерную колбу вместимостью 5 см вносят 1 см раствора смеси фитостеринов, доводят объем раствора до метки н -гексаном и перемешивают.

Срок хранения раствора в плотно закрытой склянке при температуре (4±2)°С - не более 6 мес.

8.2.6 Рабочий раствор смеси холестерина и фитостеринов массовой концентрации холестерина 2,5 мг/ см и фитостеринов (суммарно) 2,5 мг/см

В стеклянную виалу вместимостью 2 см вносят 0,5 см раствора смеси фитостеринов, приготовленного по 8.2.5, и 0,5 см раствора холестерина, приготовленного по 8.2.4, и тщательно перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа.

8.3 Подготовка хромато-масс-спектрометра

Хромато-масс-спектрометр для анализа в режиме ионизации пробы электронным ударом готовят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и устанавливают режим для анализа.

Примерный вид режима приведен ниже:

а) режим хроматографирования:

инжектируемый объем анализируемой пробы - 1 мм;

деление потока - 1:1;

температура испарителя - 310°С;

время задержки включения детектора - 28 мин;

тип колонки - HP-5MS;

газ-носитель - гелий;

скорость потока гелия через колонку - 1 см/мин;

программирование температуры термостата:

- начальная температура колонки - 115°С, время анализа при этой температуре - 1 мин;

- скорость нагрева колонки от 9°С/мин до 260°С, от 3°С/мин до 290°С;

б) режим масс-спектрометра:

энергия ионизации - 70 эВ;

температура ионного источника - 230°С;

температура квадруполя - 150°С;

температура ГХ/МС интерфейса - 290°С;

диапазон сканирования масс ионов: 35-450 а.е.м.

При соблюдении вышеуказанных условий продолжительность анализа составляет 45 мин.

8.4 Градуировка хроматографа

Градуировка хроматографа заключается в определении времени удерживания анализируемых стеринов (приложение А) и выполняется путем анализа рабочего раствора смеси холестерина и фитостеринов по 8.2.6 в условиях, приведенных в 8.3. Масс-спектрометрический анализ проводят в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) характеристических ионов стеринов. Значения масс характеристических ионов приведены в таблице 1.


Таблица 1 - Значения масс характеристических ионов холестерина и фитостеринов

Наименование

Характеристические ионы, а.е.м.

подтверждающие

Холестерин

Брассикастерин

Кампестерин

Стигмастерин

Ситостерин

При наличии плохо разделенных хроматографических пиков стеринов корректируют режим хроматографирования.

Критерии приемлемости результатов анализа и проверки работоспособности хроматографической системы заключаются в следующем:

Хроматографическая система считается работоспособной, если выполняются следующеие условия:

- разрешение между пиками стеринов на хроматограмме рабочего раствора не менее 1,5;

- асимметрия пиков на хроматограмме рабочего раствора не более 1,5;

- число теоретических тарелок по пику холестерина не менее 500000;

- СКО по площади пика холестерина по шести параллельным измерениям рабочего раствора не более 5%, а по времени удерживания - не более 1%.

Результат анализа рабочего раствора является приемлемым при условии, что соотношение сигнал/шум для пика холестерина не менее 150.

Пики фитостеринов с интенсивностью сигнала менее 2% от высоты пика холестерина или с соотношением сигнал/шум менее 3 во внимание не принимают.

8.5 Подготовка проб

8.5.1 Метод с предварительным выделением жира

8.5.1.1 Жир молочный, масло сливочное и топленое, пасты масляные

Пробу продукта массой (40-50) г расплавляют в химическом стакане вместимостью 100 см в сушильном шкафу при температуре (45±2)°С для расслоения на жировую и водную фазу. Затем жировую фазу фильтруют через сухую фильтровальную бумагу так, чтобы водная фаза не попадала на фильтр. Если отфильтрованный жир будет прозрачным, то продолжают подготовку пробы по 8.5.1.9. При наличии в отфильтрованном жире мути его фильтруют повторно.

8.5.1.2 Сырое молоко и сырые сливки, питьевое молоко и питьевые сливки

1 вариант. В коническую колбу вместимостью 500 см помещают 400 см пробы продукта. Пробу нагревают на водяной бане до температуры (75±2)°С, добавляют 15 см осадительного реактива по 8.2.2 и продолжают нагревать до получения сгустка, который фильтруют через фильтровальную бумагу, промывают его теплой водой. Осадок переносят в фарфоровую ступку, перемешивают его с достаточным количеством безводного сульфата натрия до получения зернистой массы.

2 вариант. Пробу продукта помещают в химический стакан вместимостью 1000 см и оставляют до скисания. Затем снимают верхний жировой слой, помещают в фарфоровую ступку и тщательно перемешивают с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

8.5.1.3 Концентрированное молоко, сгущенное молоко и мороженое

В конической колбе вместимостью 250 см взвешивают (100,0±1,0) г продукта.

Мороженое предварительно освобождают от глазури и других отделяемых компонентов. В пробу продукта добавляют 100 см дистиллированной воды, нагревают смесь на водяной бане до температуры (75±2)°С, добавляют 15 см осадительного реактива и продолжают нагревать до получения сгустка, который фильтруют через фильтровальную бумагу, промывают его теплой водой до обесцвечивания фильтрата. Осадок переносят в фарфоровую ступку, перемешивают его с безводным сернокислым натрием, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

8.5.1.4 Сметана и продукты на ее основе

100 г пробы продукта тщательно перемешивают в фарфоровой ступке с безводным сульфатом натрия, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

8.5.1.5 Сухие молочные продукты

В фарфоровой ступке взвешивают (300,0±1,0) г пробы продукта и добавляют 300 см дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой до однородной консистенции и оставляют на 60 мин до набухания белков и перемешивают в фарфоровой ступке с безводным сульфатом натрия, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой массы.

8.5.1.6 Творог и творожные продукты

100 г пробы продукта перемешивают в фарфоровой ступке с безводным сульфатом натрия, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой консистенции.

8.5.1.7 Сыр

100 г пробы продукта измельчают при помощи терки, помещают в фарфоровую ступку и растирают с безводным сульфатом натрия, взятым в количестве, достаточном для образования зернистой консистенции.

8.5.1.8 Выделение жира

Пробу продукта, полученную по 8.5.1.2-8.5.1.7, переносят в колбу на 250 см и добавляют 100-150 смн -гексана, встряхивая на перемешивающем устройстве или вручную и экстрагируют жир. Растворитель полностью удаляют на роторном испарителе при температуре 40°С.

В случае если дальнейший анализ пробы не может быть проведен сразу, то жир, выделенный по 8.5.1.8, хранят в холодильнике при температуре (4±2)°С не более 3 мес.

8.5.1.9 Получение свободных стеринов

(1,0±0,1) г жира, выделенного по 8.5.1.8, вносят в коническую колбу вместимостью 150 см, добавляют 0,3 г гидроокиси натрия, 30 см этилового спирта и проводят гидролиз: кипятят с обратным холодильником на электроплитке в течение 60 мин. Содержимое колбы после омыления должно представлять собой однородный прозрачный раствор, который охлаждают в вытяжном шкафу при комнатной температуре до 40°С. В колбу добавляют 30 см дистиллированной воды. Содержимое колбы помещают в делительную воронку вместимостью 250 см, добавляют 15 смн -гексана и экстрагируют неомыляемые вещества, осторожно встряхивая в течение одной минуты. Для лучшего разделения слоев добавляют 2-4 см этилового спирта. После расслоения фаз верхний гексановый слой сливают в коническую колбу, а нижний слой дважды подвергают повторной экстракции с новыми порциями по 15 смн -гексана. Гексановые экстракты помещают в делительную воронку. Экстракцию неомыляемых веществ проводят по возможности быстро, предохраняя пробу от попадания на нее прямого солнечного света. Объединенный н н -гексановую фракцию пропускают через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия, переносят в колбу для упаривания, концентрируют на роторном испарителе при температуре (40±5)°С до получения раствора объемом 1,5-2,0 см и переносят в виалу. Концентрированный раствор анализируют с помощью газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

8.5.2 Ускоренный метод выделения жира

В соответствии с таблицей 2 в коническую колбу вместимостью 150 см вносят анализируемую пробу продукта, добавляют 0,5 г гидроокиси натрия, 30 см этилового спирта и проводят гидролиз: кипятят на водяной бане с обратным холодильником на электроплитке 60 мин. Содержимое колбы охлаждают до температуры 40°С и добавляют 30 см дистиллированной воды. Содержимое колбы помещают в делительную воронку вместимостью 250 см, добавляют 15 смн -гексана и экстрагируют неомыляемые вещества, осторожно встряхивая в течение одной минуты. Для лучшего разделения слоев добавляют 2-4 см этилового спирта.


Таблица 2 - Рекомендуемая масса анализируемой пробы продукта

В граммах

Наименование продукта

Анализируемая проба

Молоко, кисломолочные продукты (за исключением сметаны)

Творог и творожные продукты

Мороженое

Масло сливочное и топленое, пасты масляные, молочный жир

Сухие молочные продукты

Примечание - Мороженое предварительно освобождают от глазури и других отделяемых компонентов. Сыр измельчают при помощи терки.

После расслоения фаз верхний н -гексановый слой сливают в коническую колбу, а с нижним слоем дважды повторяют экстракцию с новыми порциями н -гексана по 15 см каждая. Экстракцию неомыляемых веществ проводят по возможности быстро, предохраняя пробу от попадания на нее прямого солнечного света. Объединенный н -гексановый слой промывают в делительной воронке несколькими порциями по 20 см дистиллированной воды до нейтральной реакции промывных вод по универсальной индикаторной бумаге. Отмытую н -гексановую фракцию пропускают через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия, переносят в колбу для упаривания, концентрируют раствор на роторном испарителе при температуре (40±5)°С до объема 1,5-2,0 см и переносят в виалу. Концентрированный раствор анализируют с помощью газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

8.5.3 Метод без предварительного выделения жира

Применяют при разногласиях в оценке качества анализируемой продукции.

В центрифужную пробирку вместимостью 50 см помещают (25,0±1,0) г молока или молочного продукта, добавляют 25 см тетрагидрофурана, закрывают крышкой, интенсивно встряхивают и центрифугируют в течение 5-10 мин на центрифуге с частотой оборотов ротора, соответствующей фактору центрифугирования не менее 5000 g .

Верхний слой в зависимости от его объема переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 или 50 см и добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:2, закрывают крышкой, интенсивно встряхивают и центрифугируют в течение 5-10 мин на центрифуге с частотой оборотов ротора, соответствующей фактору центрифугирования не менее 5000 g .

(5,00±0,01) см пробы очищенного раствора молочного жира переносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см для щелочного гидролиза.

В центрифужную пробирку с пробой раствора молочного жира добавляют такое же количество по объему раствора гидроксида калия в метаноле, приготовленного по 8.2.3, интенсивно перемешивают в течение минуты, добавляют 10 смн- гексана, интенсивно перемешивают в течение одной минуты и центрифугируют в течение 10 мин на центрифуге с частотой оборотов ротора, соответствующей фактору центрифугирования не менее 5000 g .

Верхний н- гексановый слой декантируют в делительную воронку и промывают несколькими порциями по 10 см дистиллированной воды до нейтральной реакции промывных вод по универсальной индикаторной бумаге. Отмытую н -гексановую фракцию пропускают через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия, переносят в колбу для упаривания, концентрируют раствор на роторном испарителе при температуре (40±5)°С до объема 1,5-2,0 см и переносят в виалу. Полученный концентрированный раствор анализируют с помощью газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

9 Проведение анализа

Для оценки фона (чистоты аналитической системы) каждый раз перед началом работы инжектируют в прибор 1 мм чистого растворителя (н -гексан) и записывают масс-хроматограмму, на которой не должно присутствовать посторонних пиков.

Отбирают 1 мм анализируемой пробы продукта, подготовленной в соответствии с 8.5, вводят в испаритель газового хроматографа и выполняют хроматографическое разделение в условиях, приведенных в 8.3. Масс-спектрометрический анализ проводят в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) характеристических ионов стеринов в соответствии с таблицей 1 по 8.4. Записывают хроматограммы и идентифицируют индивидуальные стерины по масс-спектру и совпадению времен удерживания.

Пробу продукта анализируют не менее двух раз.

10 Обработка результатов анализа

После проведения анализа с помощью системы обработки данных фиксируют на масс-хроматограммах пики в области времен удерживания, соответствующих выходу холестерина и фитостеринов.

Фитостерины считают обнаруженными при выполнении ряда условий:

- интенсивность отклика сигнала в единицах шума для пика не менее 3 и по интенсивности сигнала холестерина не менее 2%;

- время удерживания стерина на хроматограмме отличается от времени удерживания рабочего раствора на хроматограмме не более чем на 1%;

- расхождение между соотношениями интенсивности отклика сигнала ионов в спектре соответствующего стерина в анализируемой пробе и в спектре того же стерина в рабочем растворе смеси, приготовленной по 8.2.6, не превышает 10%.

Не учитывают пики фитостеринов с интенсивностью отклика сигнала не более 2% от высоты пика холестерина или с соотношением сигнал/шум не более 3.

Наличие -ситостерина или других фитостеринов в жировой фазе анализируемой пробы продукта свидетельствует о присутствии в ней растительных масел или жиров на растительной основе (см. приложение Б).

11 Оформление результатов анализа

Результат обнаружения растительных масел и жиров на растительной основе представляют в документах в виде наличия или отсутствия каждого стерина в отдельности, на основании чего делают заключение о фальсификации или нефальсификации жировой фазы пробы продукта растительными маслами или жирами на растительной основе.

12 Контроль качества анализа

Контроль качества результатов анализа обеспечивают путем проверки работоспособности хроматографической системы, оценки ее чистоты, выполнения критериев приемлемости результатов анализа и условий в соответствии с 8.4 и разделом 9.

13 Требования, обеспечивающие безопасность

13.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении работ следует соблюдать следующие требования:

- помещение, в котором проводят анализ, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021 . Работу с реактивами необходимо проводить в вытяжном шкафу. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005 ;
- при работе с концентрированными кислотами и щелочами необходимо использовать спецодежду, защитные очки и резиновые перчатки. При выполнении анализов следует соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007 .

13.2 Требования к квалификации оператора

К выполнению работ допускаются лица, имеющие квалификацию инженер, техник или лаборант, владеющие знаниями в области газовой хроматографии и масс-спектрометрии, навыками проведения анализа и изучившие инструкцию по эксплуатации используемой аппаратуры.

Приложение А (справочное). Хроматограмма рабочего раствора смеси холестерина и фитостеринов

Приложение А
(справочное)

А.1 Хроматограмма рабочего раствора смеси холестерина и фитостеринов приведена на рисунке А.1.

Рисунок А.1 - Хроматограмма, полученная при разделении рабочего раствора смеси холестерина и фитостеринов по 8.2.5, на колонке HP-5MS (с нанесенной неполярной жидкой фазой - 5% фенил и 95% диметилсилоксан, длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной нанесения жидкой фазы 0,25 мкм) в условиях, приведенных в 8.3

Приложение Б (справочное). Хроматограммы стериновой фракции жировой фазы пробы продукта, не фальсифицированного и фальсифицированного растительными маслами или жирами на растительной основе

Приложение Б
(справочное)

Б.1 Хроматограмма стериновой фракции жировой фазы пробы продукта, не фальсифицированного растительными маслами или жирами на растительной основе, приведена на рисунке Б.1

Рисунок Б.1 - Хроматограмма стериновой фракции жировой фазы пробы продукта, не фальсифицированного растительными маслами или жирами на растительной основе

Б.2 Хроматограмма стериновой фракции жировой фазы пробы продукта, фальсифицированного растительными маслами или жирами на растительной основе, приведена на рисунке Б.2.

Рисунок Б.2 - Хроматограмма стериновой фракции жировой фазы пробы продукта, фальсифицированного растительными маслами или жирами на растительной основе

Библиография

Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 033/2013 "О безопасности молока и молочной продукции", принятый Решением Совета Евразийской Экономической комиссии N 67 от 9 октября 2013 г .

УДК 637.147.2:543:06:006.354

МКС 67.100.10

Ключевые слова: молоко, продукты молочные, жир молочный, обнаружение растительных масел и жиров на растительной основе, газожидкостная хроматография, масс-спектрометрическое детектирование, стерины, омыление, хромато-масс-спектрометр



Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2016

Все документы, представленные в каталоге, не являются их официальным изданием и предназначены исключительно для ознакомительных целей. Электронные копии этих документов могут распространяться без всяких ограничений. Вы можете размещать информацию с этого сайта на любом другом сайте.

ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ
ВЕЩЕСТВ В ПОЧВЕ И ОТХОДАХ
ПРОИЗВОДСТВА И ПОТРЕБЛЕНИЯ


МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.1061-01

Минздрав России
Москва 2001

1. Подготовлены д. б. н. А.Б. Малышевой, проф., д. м. н. Н.В. Русаковым, к. х. н. Е.Г. Растянниковым, к. х. н. А.А. Беззубовым (НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 18 июля 2001 г.

3. Введены впервые.

Предисловие

Учитывая многокомпонентность химического загрязнения, актуальность приобретает аналитический контроль, ориентированный на идентификацию возможно более широкого спектра загрязняющих веществ и последующее проведение целевых анализов по выбранным на его основе ведущим показателям. В связи с этим в последнее время внимание уделяется разработке многокомпонентных аналитических методов контроля на основе использования хромато-масс-спектрометрии. Настоящие методические указания позволяют, с одной стороны, проводить идентификацию широкого спектра летучих и труднолетучих органических соединений в почве, твердых бытовых и промышленных отходах, осадках сточных вод и т.д. и, с другой стороны, являются аналитическим методом контроля 12 летучих и 34 труднолетучих органических соединений. Эти методики также могут быть применены для решения разнообразных гигиенических задач, направленных на поиск неизвестных соединений, без решения которых невозможно оценить уровень загрязнения почвы или степень опасности отхода. Результаты исследований могут послужить основанием для проведения санитарно-гигиенических, технологических, рекультивационных и других мероприятий по охране здоровья человека и условий его жизнедеятельности.

д. б. н. А.Г. Малышева, проф., д. м. н. Н.В. Русаков

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный

санитарный врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

МУК 4.1.1061-01

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Хромато-масс-спектрометрическое определение
летучих органических веществ в почве
и отходах производства и потребления

Методические указания

1. Область применения

Методические указания по хромато-масс-спектрометрическому определению летучих органических веществ в почве и отходах предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий, лабораторий научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды. Методические указания разработаны с целью обеспечения аналитического контроля летучих органических веществ в почве и отходах для оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам или требованиям. Методические указания могут быть использованы для оценки уровня загрязнения почвы и определения степени опасности твердых бытовых и промышленных отходов.

2. Общие положения

Настоящие методические указания дают возможность с использованием хромато-масс-спектрометрии идентифицировать и количественно определять 12 летучих органических соединений в почве и отходах производства и потребления в диапазоне концентраций 0,01 - 1,0 мг/кг. Методика метрологически аттестована.

Методические указания одобрены и рекомендованы к практическому использованию секциями: «Физико-химические методы исследования объектов окружающей среды» и «Гигиена почвы и промотходов» при Проблемной комиссии «Научные основы экологии человека и гигиены окружающей среды».

Физико-химические свойства, масс-спектральные характеристики и гигиенические нормативы приведены в табл. .

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей ±20 % при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерение концентраций летучих органических веществ основано на извлечении их из почвы или отходов нагреванием, концентрировании на твердом полимерном адсорбенте, последующей термической десорбции с криогенным фокусированием в стеклянном капилляре, газохроматографическом разделении на кварцевой капиллярной колонке, идентификации по масс-спектрам и количественном определении по градуировочным характеристикам.

Нижний предел измерения ароматических углеводородов в массе пробы 1 г составляет 0,01 мкг, спиртов - 0,02 мкг, четыреххлористого углерода и других хлорсодержащих соединений - 0,03 мкг.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

5.1. Средства измерений

Хромато-масс-спектрометр с магнитным или квадрупольным масс-анализатором

Компьютерная система, обеспечивающая сбор и хранение всех масс-спектров в процессе проведения хромато-масс-спектрометрического анализа

Весы аналитические ВЛА-200ГОСТ 24104-80Е

Мерные колбы, вместимостью 50 и 100 см 3 ГОСТ 1770-74

Меры массыГОСТ 7328-82Е

Микрошприц МШ-10МГОСТ 8043-75

Стеклянные пипетки, вместимостью 1, 2, 5, 10, 25 см 3 ГОСТ 29169-91

Секундомер СД пр. 1-2-000ГОСТ 5072-79


Таблица 1

Физико-химические свойства*, масс-спектральные характеристики и гигиенические нормативы веществ

Наименование вещества

Формула

Мол. масса

Т кип. С °

Плотность г/см 3

Растворимость, г/л

ПДК мг/кг

Масс-спектры

вода

этанол

эфир

Бензол

С 6 Н 6

78,0

80,0

0,879

0,82

Толуол

С 7 Н 8

92,0

110,0

0,867

0,57

Этилбензол

С 8 Н 10

106,1

136,2

0,867

0,14

м, п-Ксилолы

С 8 Н 10

106,1

138,3

0,861

н. р

л. р

л. р

о-Ксилол

С 8 Н 10

106,1

144,4

0,880

н. р

л. р

л. р

Стирол

С 8 Н 8

104,15

145,2

0,906

т. р

Изобутанол

С 4 Н 10 О

74,1

108,0

0,802

Углерод четыреххлористый

С Cl 4

153,81

76,8

1,632

Бутанол

С 4 Н 10 О

74,1

117,3

0,810

Хлороформ

CHCl 3

119,37

61,3

1,498

1, 2-Дихлорэтан

C 2 H 2 Cl 2

98,25

83,7

1,258

0,92

Хлорбензол

С 6 Н 5 Cl

112,6

132,0

1,107

0,49

* Величины приведены из Справочника химика (1963), растворимость указана при температуре 20 ° С.


5.2. Вспомогательные устройства

Гайки накидные с прокладками из витона (диаметр отверстия - 6,0 мм)

Колонка хроматографическая кварцевая капиллярная, длиной 60 м и внутренним диаметром 0,32 мм, покрытая неподвижной фазой SPB -1 (диметилполисилоксан) с толщиной пленки 1 мкм

Капилляр стеклянный U -образный, длиной 140 мм и диаметром 0,7 мм

Капилляр стеклянный толстостенный, длиной 200 мм, наружным диаметром 6,0 мм и внутренним диаметром 0,5 мм

Сосуд Дьюара стеклянный, высотой 80 мм и внутренним диаметром 25 мм

Ступка фарфоровая с пестиком

Трубки сорбционные из молибденового стекла, длиной 200 мм и внутренним диаметром 5,6 мм

Трубки из молибденового стекла полые, длиной 200 мм и внутренним диаметром 5,6 мм

Эксикатор

Электропечь трубчатая раздвижная, длиной 150 мм и диаметром 25 мм

Электропечь трубчатая, длиной 160 мм и диаметром 13 мм

Вкладыши для электропечей латунные разъемные, длиной 150 мм и 170 мм и внутренним диаметром по 7,0 мм каждый

5.3. Материалы

Заглушки из фторопласта для сорбционных трубок

Мешочки для активированного угля марлевые

Стекловата силанизированная

5.4. Реактивы

Азот жидкий

Активированный уголь любой марки

Бензол, х. ч.ГОСТ 5955-75

Бутанол, х. ч.ТУ 6-09-1708-77

Вода артезианская, дополнительно очищенная кипячением

Гелий газообразный марки А в баллонеТУ 31-940-80

1, 2-Дихлорэтан, х. ч.ТУ 6-09-2667-78

Изобутанол, х. ч.ТУ 6-09-4354-77

м-Ксилол, х. ч.ТУ 6-09-4556-77

о-Ксилол, х. ч.ТУ 6-09-9156-76

п-Ксилол, х. ч.ТУ 6-09-46-09-78

Силикагель КСК, крупнозернистый

Стирол, х. ч.ТУ 6-09-3998-78

Тенакс GC , зернением 0,2 - 0,25 мм фирмы « Altech Assciates », США

Толуол, х. ч.ГОСТ 5789-78

Углерод четыреххлористый, х. ч.ГОСТ 20228-74

Хлорбензол, х. ч.ГОСТ 646-73

Хлороформ, х. ч.ГОСТ 20015-74

Этанол, х. ч.ГОСТ 18300-72

Этилбензол, х. ч.ГОСТ 9385-77

6. Требования безопасности

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88 .

При выполнении измерений с использованием хромато-масс-спектрометра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации приборов.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика, с опытом работы на хромато-масс-спектрометре.

8. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

· процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях согласно ГОСТу 15150-69 при температуре воздуха (20±5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %;

· выполнение измерений на хромато-масс-спектрометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка сорбционных трубок, приготовление растворов, подготовка хроматографической системы, установление градуировочной характеристики, подготовка проб.

9.1. Приготовление сорбционных трубок

Сорбционную трубку заполняют полимерным сорбентом тенакс, закрывают концы тампонами из стекловаты, помещают в нагретую до 300 °С трубчатую раздвижную электропечь и выдерживают в токе гелия при скорости 15 см 3 /мин в течение 24 ч. По окончании кондиционирования трубки с заглушенными концами помещают для хранения в промытый и тщательно просушенный эксикатор, на дно которого насыпан слой сухого силикагеля КСК, а по бокам расположены марлевые мешочки с активированным углем.

9.2. Приготовление растворов

Исходные растворы бензола, бутанола, 1, 2-дихлорэтана, изобутанола, о-, м-, п-ксилолов, стирола, толуола, четыреххлористого углерода, хлорбензола, хлороформа и этилбензола для градуировки (с = 1 мг/см 3). 50 мг каждого из указанных соединений вносят в мерные колбы, вместимостью 50 см 3 , доводят этанолом до метки и перемешивают. Срок хранения каждого раствора - 1 месяц при 4 °С.

Рабочие растворы для градуировки. В мерные колбы, вместимостью 100 см 3 , в соответствии с табл. , помещают исходные растворы каждого из соединений, доводят артезианской водой до метки и перемешивают. Срок хранения градуировочных растворов - 2 дня при 4 °С.

Таблица 2

Градуировочные растворы для установления градуировочной характеристики при определении летучих органических веществ в почве

Номер раствора

Объем каждого исходного раствора (1 мг/см 3), см 3

Концентрация вещества в растворе, мг/см 3

0,01

0,02

0,04

Количество вещества в 1 мм 3 , мкг

0,01

0,02

0,04

9.3. Подготовка хроматографической системы

На крышке термостата газового хроматографа устанавливают штатив с вертикально закрепленной на нем трубчатой электропечью, внутри которой помещают толстостенный стеклянный капилляр, к которому подводят газ-носитель гелий. Выход капилляра с помощью накидных гаек с прокладками из витона соединяют с U -образным стеклянным капилляром, который, в свою очередь, подсоединяют непосредственно к стеклянной капиллярной хроматографической колонке. После того как газовая линия хроматографической системы проверена на отсутствие утечек гелия, закрывают дверцу термостата хроматографа и проводят кондиционирование хроматографической колонки в токе гелия, поднимая температуру термостата со скоростью 5 °С/мин до 250 °С. Колонку выдерживают при этой температуре в течение суток. После охлаждения термостата хроматографа до комнатной температуры выход колонки подсоединяют к молекулярному сепаратору масс-спектрометра и записывают нулевую линию. При отсутствии заметных флуктуаций система готова к работе.

9.4. Установление градуированной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки на градуировочных растворах летучих органических веществ. Она выражает зависимость площади пика (безразмерные компьютерные единицы) от количества (мкг) каждого соединения и строится по семи сериям градуировочных растворов. Учитывая нелинейность детектора полного ионного тока в диапазоне концентраций 0,01 - 1,0 мг/см 3 , градуировочный график разбивают на два поддиапазона: 0,01 - 0,1 мг/см 3 и 0,1 - 1,0 мг/см 3 .

Для построения градуировочного графика каждый из градуировочных растворов с помощью микрошприца, объемом 1 мм 3 , вводят в середину трубки из молибденового стекла, заполненной 1,0 г сухого, неоднократно прокаленного (с целью устранения исходного загрязнения летучими органическими веществами) образца почвы или отхода. Далее пробу из этой трубки методом термической десорбции переводят в сорбционную трубку с тенаксом. Для этого трубки соединяют друг с другом, первую из них (с пробой) помещают в предварительно нагретую до 280 - 300 °С раздвижную трубчатую электропечь и в течение 10 мин пропускают через них гелий со скоростью 15 см 3 /мин. По завершении этой операции сорбционную трубку отсоединяют.

Градуировку детектора полного ионного тока хромато-масс-спектрометра проводят при следующих условиях: температура хроматографической колонки в течение первых 5 мин комнатная, затем программируется до 250 °С со скоростью 6,5 °С/мин;

температура термодесорбции280 - 300 °С;

расход газа-носителя1,8 см 3 /мин;

ионизирующее напряжение в момент записи хроматограммы20 В;

ионизирующее напряжение в момент записи масс-спектра70 В;

ток эмиссии50 мкА;

ускоряющее напряжение3500 В;

температура ионного источника270 °С;

температура сепаратора200 °С;

диапазон сканируемых масс25 - 236 а. е. м.;

скорость сканирования магнитного поля магнита250 масс/сек.

Находящийся внутри термостата и соединенный с хроматографической колонкой U -образный стеклянный капилляр погружают в сосуд Дьюара с жидким азотом. Затем, ослабив обжимные гайки, из холодной электропечи извлекают постоянно находящийся в ней толстостенный стеклянный капилляр и вместо него герметично закрепляют сорбционную трубку. В пространство между наружной стенкой сорбционной трубки и внутренней стенкой электропечи помещают термопару от испарителя хроматографа для контроля за температурой термодесорбции. Через 2 - 3 мин после вытеснения воздуха из сорбционной трубки включают электропечь, которая постепенно в течение 8 - 10 мин прогревается до 300 °С. Эту температуру выдерживают еще 1 - 2 мин, после чего нагрев отключают. В течение этого времени газ-носитель полностью освобождает сорбционную трубку от введенных в нее веществ и переносит их в U -образный охлажденный капилляр. По завершении термодесорбции и криогенного фокусирования жидкий азот убирают и U -образный капилляр на 10 сек погружают в стаканчик с налитой в него горячей водой (температура - не менее 90 °С), в результате чего вещества компактно переносятся в капиллярную хроматографическую колонку. После завершения хроматографического анализа нагрев термостата отключают, охлаждают хроматографическую колонку до комнатной температуры и извлекают охлажденную сорбционную трубку из электропечи, вставляя вместо нее толстостенный стеклянный капилляр.

На полученных хроматограммах с помощью программы интегрирования рассчитывают площади пиков соединений и по средним результатам из 4 измерений строят градуировочную характеристику для каждого из компонентов. Градуировку проводят раз в полгода и обязательно после ремонта хромато-масс-спектрометра.

9.5. Отбор проб

Пробы почвы и отходов отбирают методом конверта в соответствии с ГОСТом 17.4.4.02.84 в стеклянные емкости темного цвета с плотными крышками. Пробы хранят при 4 °С в течение недели.

10. Выполнение измерений

Отобранные точечные пробы извлекают из холодильника, выдерживают при комнатной температуре 2 - 3 ч, затем содержимое всех емкостей объединяют в фарфоровой ступке, аккуратно истирают пестиком конгломераты размером более 3 - 5 мм, переносят сыпучую массу в емкость с пробкой и тщательно перемешивают. Далее из этой массы гомогенизированной пробы 1 г образца фракции 0,5 - 1 мм помещают в полую трубку из молибденового стекла и фиксируют его (образец) с обеих сторон тампонами из стекловаты. Перевод содержащихся в пробе веществ в сорбционную трубку с тенаксом и последующий хромато-масс-спектрометрический анализ проводят в соответствии с п. . Одновременно с началом проведения анализа включают компьютерную программу автоматического сканирования и сбора масс-спектрометрической информации. По окончании хроматографического анализа из массива масс-спектров формируют хроматограмму полного ионного тока, по которой проводят идентификацию обнаруженных соединений. Идентификация заключается в сравнении записанных масс-спектров со стандартными (см. табл. ). Параллельно с проведением хромато-масс-спектрометрического анализа определяют влажность почвы, для чего 15 г материала помещают в химический стакан, высушивают его при температуре 105±2 °С в течение 8 ч и доводят до постоянной массы, периодически, не менее 2 - 3 раз, взвешивая охлаждаемый до комнатной температуры стакан.

11. Вычисление результатов измерений

Абсолютное массовое количество каждого идентифицированного вещества (мкг) определяют по его градуировочной характеристике после компьютерного интегрирования хроматограммы полного ионного тока. Концентрацию вещества С в образце почвы (мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

а - абсолютное массовое количество вещества в пробе, определенное в 1 г пробы (мкг);

K - поправочный коэффициент, учитывающий влажность почвы (отходов)

, где

W - влажность почвы (отходов) при комнатной температуре (%);

, где

т 1 - масса влажной почвы (отходов) со стаканом (г);

т 0 - масса высушенной почвы (отходов) со стаканом (г);

т - масса стакана (г).

12. Оформление результатов измерений

Результаты анализа (измерений) представляют в виде: С, мг/кг ± 20 % или С ± 0,2 С мг/кг.

13. Контроль погрешности измерений

Проводят контроль погрешности измерений содержания каждого вещества при помощи градуировочных растворов. Рассчитывают среднее значение результатов измерений содержания вещества, введенного в почвенный материал из градуировочного раствора, отнесенное к единице массы почвы (отходов) (кг):

, где

п - число измерений содержания вещества, введенного из градуировочного раствора;

С ni - результат измерения содержания вещества i -го измерения (мг/кг).

Рассчитывают среднее квадратичное отклонение результата измерения концентрации каждого введенного органического вещества:

Рассчитывают доверительный интервал

, где

t - коэффициент нормированных отклонений, определяемый по таблицам Стъюдента, при доверительной вероятности 0,95, и затем относительную погрешность определения концентраций:

Если δ £ 20 %, то погрешность измерений удовлетворительная.

ГОСТ 31694-2012

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Food products, food raw materials. Method of determination of the antibiotic residues of tetracycline group by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry


МКС 67.050
67.100

Дата введения 2013-07-01

Предисловие

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51-2012)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по
МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

Госстандарт Республики Казахстан

Кыргызстан

Кыргызстандарт

Молдова-Стандарт

Российская Федерация

Росстандарт

Узбекистан

Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1424-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31694-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 июля 2013 г.

5 Стандарт подготовлен на основе ГОСТ Р 53601-2009

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты"


ВНЕСЕНО Изменение N 1 , утвержденное и введенное в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 октября 2016 года N 1523-ст c 01.03.2017

Изменение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту ИУС N 2, 2017 год

ВНЕСЕНЫ: поправка , опубликованная в ИУС N 7, 2017 год; поправка , опубликованная в ИУС N 10, 2018 год

Поправки внесены изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод идентификации и количественного определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в молоке, молочной продукции, яйцах, яичном порошке, меде, органах и тканях животных в продуктах переработки мясного сырья, мяса птицы, субпродуктах, в том числе птичьих, рыбе, нерыбных объектах и продукции из них с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 1,0 до 1000,0 мкг/кг.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 * Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".


ГОСТ 12.2.085-2002 Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 908-2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003** Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
________________
** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".


ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N, N, N", N"-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначения чистоты

ГОСТ 19792-2001 *** Мед натуральный. Технические условия
________________
*** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 54644-2011 "Мед натуральный. Технические условия".


ГОСТ 24104-2001 **** Весы лабораторные. Общие технические требования
________________
**** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".


ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29245-91 Консервы молочные. Методы определения физических и органолептических показателей

ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 31467-2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

ГОСТ 31654-2012 Яйца куриные пищевые. Технические условия

ГОСТ 31720-2012 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы отбора проб и органолептического анализа"

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.


(Измененная редакция, Изм. N 1), (Поправка . ИУС N 10-2018).

3 Сущность метода

3.1 Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Метод ВЭЖХ-МС/МС обеспечивает хроматографическое разделение антибиотиков тетрациклиновой группы и их эпи-форм (приложение А).

3.2 Количественное определение остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы проводят методом внутреннего стандарта по сумме площадей пиков идентифицированных соединений и их эпи-форм для каждого антибиотика при помощи градуировочной кривой.

3.3 Детектирование анализируемых проб проводят в режиме регистрации выбранных реакций.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

4.1 При определении содержания антибиотиков тетрациклиновой группы применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

- масс-спектрометр с диапазоном измерения от 100 до 500 атомных единиц массы (а.е.м.), массовым разрешением не менее 500, точностью измерения массы не ниже 0,2 а.е.м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);

- систему высокоэффективную жидкостную хроматографическую, состоящую из бинарного насоса со смесителем; термостата хроматографической колонки, обеспечивающего температуру нагрева до 50°С;

- компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов масс-спектрометрических измерений;

- весы лабораторные по ГОСТ 24104 , высокого или специального класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 и 500 г с ценой поверочного деления 0,1 и 1,0 мг соответственно;

- рН-метр с набором электродов, с пределами абсолютной погрешности измерений ±0,01 рН;

- пипетки одноканальные переменного объема 10-100 мм, 40-200 мм, 200-1000 мм, 1-5 см;

- пробирки мерные стеклянные П-1-5-0,1ХС, П-2-10-14/23 по ГОСТ 1770 ;

- пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227 ;

- колбы мерные стеклянные К-2-100-2, К-2-1000-2 по ГОСТ 1770 ;

- виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками ;

- фильтры мембранные с размером пор не более 0,5 мкм ;

- измельчитель-гомогенизатор лабораторный ;

- встряхиватель вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин ;

- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения ротора не менее 10000 об/мин и диапазоном температур охлаждения от 4°С до 20°С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см ;

- модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40°С ;

- баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм ;

- колонку хроматографическую обращенно-фазную длиной не менее 50 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм;

- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

- картридж для твердофазной экстракции объемом не менее 12 см, заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм;

- камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 18°С до минус 24°С;

- холодильник бытовой с морозильной камерой, цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0°С до 5°С.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2 При определении содержания антибиотиков тетрациклиновой группы применяют следующие реактивы:

- кислоту лимонную пищевую по ГОСТ 908 , высшего сорта;

- метанол х.ч.;

- ацетонитрил ч.д.а.;

- деионизованную воду;

- муравьиную кислоту ч.д.а. по ГОСТ 5848 ;

- натрий фосфорнокислый двузамещенный дигидрат ч.д.а по ГОСТ 245 ;

- соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б) по ГОСТ 10652 ;

- ортофосфорную кислоту по ГОСТ 6552 ;

- этилацетат по ГОСТ 8981 ;

- ацетон по ГОСТ 2603 ;

- стандартный образец тетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90% ;

- стандартный образец окситетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90% ;

- стандартный образец хлортетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90% ;

- стандартный образец доксициклина с содержанием действующего вещества не менее 90% ;

- стандартный образец демеклоциклина с содержанием действующего вещества не менее 90% .

Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867 .

5 Требования безопасности

5.1 Используемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности по ГОСТ 12.1.007 , при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 .

5.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

5.3 Операции по приготовлению и дозированию градуировочных растворов следует проводить под тягой в вытяжном шкафу.

5.4 В связи с тем, что при работе на хромато-масс-спектрометре используется сжатый азот, следует соблюдать требования ГОСТ 12.2.085 и правил устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением, действующих на территории государства, принявшего стандарт.

5.5 При выполнении измерений на хромато-масс-спектрометре следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.6 К выполнению измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации аппаратуры.

6 Порядок подготовки к проведению измерений

6.1 Отбор проб

6.1.1 Отбор проб проводят в соответствии с методическими указаниями по отбору проб пищевой продукции с целью лабораторного контроля качества и безопасности, утвержденными на территории государства, принявшего стандарт.

6.1.2 Отбор проб органов, тканей животных и птицы производят в соответствии с ГОСТ 31467 . Масса средней пробы органов, тканей животных и птицы не менее 200 г.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.1.3 Отбор проб молока и молочных продуктов производят в соответствии с ГОСТ 26809.1 и ГОСТ 26809.2 . Объем средней пробы молока не менее 200 см, масса средней пробы образцов молочных продуктов не менее 250 г.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.1.4 Отбор проб меда производят в соответствии с ГОСТ 19792 . Масса средней пробы меда не менее 200 г.

6.1.5 Отбор проб яиц и яичного порошка производят в соответствии с ГОСТ 31654 и ГОСТ 31720 . От яиц в качестве средней пробы отбирают не менее 12 шт.; масса средней пробы яичного порошка не менее 200 г.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.1.6 Отбор проб рыбы, нерыбных объектов и продукции из них проводят по ГОСТ 31339 . Срок хранения отобранных проб при температуре от 2°С до 8°С - двое суток. При отсутствии возможности исследования проб в течение двух суток образцы должны быть заморожены при температуре минус 20°С на срок хранения не более 2 мес.

(Введен дополнительно, Изм. N 1).

6.2 Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы к выполнению измерений

Подготовку хромато-масс-спектрометра к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора.

При этом должны быть соблюдены следующие условия:

Температура окружающего воздуха

от 15°С до 30°С;

Атмосферное давление

от 84 до 106 кПа;

Относительная влажность воздуха

от 20% до 80%.

(Поправка . ИУС N 7-2017).

6.3 Приготовление растворов

6.3.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят 21 г лимонной кислоты, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.


6.3.2 Приготовление раствора гидрофосфата натрия молярной концентрации 0,2 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят 35,6 г двузамещенного фосфата натрия, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.3 Приготовление буферного раствора

Для приготовления буферного раствора в мерной колбе вместимостью 1000 см смешивают в соотношении 60:40 растворы лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, полученные по 6.3.1 и 6.3.2, добавляют 37,2 г трилона Б, измеряют рН и, при необходимости, доводят значение рН до 4,0 ортофосфорной кислотой.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

6.3.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

6.3.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см приливают деионизованную воду, добавляют 5 см муравьиной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см приливают метиловый спирт, добавляют 5 см муравьиной кислоты и доводят объем до метки метиловым спиртом.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.5 Приготовление градуировочных растворов

6.3.5.1 Приготовление градуировочных растворов тетрациклинов

Для приготовления градуировочных растворов тетрациклинов на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают по 10 мг каждого стандартного образца по 4.1 (кроме демеклоциклина) и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см. Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин и доводят полученный раствор до метки метанолом.

Массовая концентрация каждого антибиотика тетрациклиновой группы в растворе составляет 1 мг/см.


6.3.5.2 Приготовление раствора демеклоциклина (внутреннего стандарта)

Для приготовления раствора внутреннего стандарта на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают 10 мг стандарта демеклоциклина гидрохлорида и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см. Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, доводят полученный раствор до метки метанолом.

Массовая концентрация внутреннего стандарта в растворе составляет 1 мг/см. Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта до значения 1 мкг/см. Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Срок хранения раствора - 3 мес при температуре минус 20°С.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре, в темном месте, не менее 20 мин.

6.4 Хроматографические условия измерений

6.4.1 Хромато-масс-спектрометр включают и настраивают в соответствии с техническим руководством по его эксплуатации и устанавливают следующие хроматографические параметры:

- скорость потока элюента - 200 мм/мин;

- объем вводимой пробы - 20 мм.

6.4.2 Детектирование пиков проводится методом "регистрации выбранных реакций". Для каждого антибиотика тетрациклиновой группы измеряется сигнал для двух фрагментных ионов согласно таблице 1.
_______________
"Регистрация выбранных реакций" - режим работы масс-спектрометра, при котором детектируется ионный ток только для выбранных фрагментных ионов выбранных ионов-прекурсоров.


Таблица 1 - Значения масс ионов-предшественников и ионов-фрагментов

Ион-предшественник, m/z*

Ионы-фрагменты, m/z*

Тетрациклин

Окситетрациклин

Доксициклин

Хлортетрациклин

Демеклоциклин

* m/z - отношение массы иона к его заряду.

Более интенсивный пик (верхний в каждой строке таблицы 1) служит для определения концентрации антибиотика, второй (нижний в каждой строке таблицы 1) используется для подтверждения правильности определения. Пики ионов-фрагментов с массой 410,1 тетрациклина и доксициклина различаются по времени их удержания в хроматографической колонке, определяемому на стадии разработки ВЭЖХ-МС/МС метода.

6.5 Построение градуировочной характеристики

6.5.1 Градуировочную кривую строят при помощи матричной градуировки. Для этого проводят обработку "чистых" проб, приготовленных и проанализированных ранее в соответствии с требованиями раздела 7, не содержащих тетрациклинов более 1 мкг/кг для каждого из антибиотиков, в зависимости от типа исследуемой матрицы. На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в мерную пробирку вместимостью 5 см, содержащую исследуемую "чистую" пробу, добавляют градуировочный раствор тетрациклинов по 6.3.5.1 с таким расчетом, чтобы окончательные массовые концентрации находились в пределах от 1 до 1000 нг/см. Затем добавляют 50 мм раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и необходимое количество мобильной фазы А по 6.3.4.1, доводя объем до 1 см.

6.5.2 Для получения градуировочных данных используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.

6.5.3 При построении градуировочной зависимости для количественного определения тетрациклинов анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в 6.2 и 6.4. Затем строят графики зависимости массовой концентрации антибиотика тетрациклиновой группы от отношения площади хроматографического пика антибиотика тетрациклиновой группы к площади пика внутреннего стандарта для каждого фрагментного иона четырех антибиотиков тетрациклиновой группы. Образец графика приведен в приложении Б.

Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи программы Excel (Microsoft Office).

6.5.4 Расчетные концентрации для обоих фрагментных ионов каждого антибиотика тетрациклиновой группы должны совпадать в пределах 20%.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой каждого фрагментного иона каждого антибиотика тетрациклиновой группы не менее 0,98.

6.6 Подготовка лабораторной посуды и реактивов

6.6.1 Мойку и сушку посуды следует проводить в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Не допускается проведение подготовки посуды в данном помещении для других видов анализов. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.

6.6.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).

6.6.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105°С до 110°С.

7 Порядок выполнения измерений

7.1 Обработка проб органов, тканей животных, яиц, яичного порошка, молока, молочных продуктов и меда , рыбы, нерыбных объектов и продукции из них*
________________
* Измененная редакция, Изм. N 1 .

7.1.1 Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани, кожи, костей и грубого хитинового покрова. Яйца отделяют от скорлупы. Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1,0 г гомогенизированной пробы в виале на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В виалу добавляют 50 мм раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 10 см экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4°С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Процедуру экстракции и центрифугирования повторяют еще один раз. Объединенные экстракты собирают в чистые виалы.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

7.1.2 1,0 г меда взвешивают на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г в виале вместимостью 50 см. В виалу добавляют 50 мм раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 20 см экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 1 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4°С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин.

7.2 Проведение твердофазной экстракции и подготовка к хроматографированию

7.2.1 Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ заполняют 0,5 г сорбента. Предварительно картридж кондиционируют 6 см метилового спирта и уравновешивают 6 см бидистиллированной воды. Затем наносят объединенный экстракт и вновь промывают 6 см бидистиллированной воды. Тетрациклины элюируют с сорбента при помощи 6 см мобильной фазы Б. Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле в токе воздуха до 0,5 см при температуре 40°С.

7.2.2 Для перерастворения и подготовки к хроматографированию объем полученного упаренного элюата в мерной пробирке вместимостью 10 см доводят до 1 см при помощи мобильной фазы А и помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Полученный экстракт фильтруют через мембранный фильтр и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

7.3 Обработка проб молока

7.3.1 Для очистки образцов к навеске образца молока массой 1 г, помещенной в виалу, добавляют 100 мм раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 3 см ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин, затем оставляют на 15 мин в горизонтальном положении для последующего уравновешивания. Далее виалу с образцом помещают на предварительно охлажденную до 4°С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Полученный раствор переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см и упаривают до 1 см на нагревательном модуле в токе воздуха при температуре 40°С. К полученному остатку добавляют 9 см буферного раствора 6.3.3 и помещают на ультразвуковую баню. Сухие молочные продукты восстанавливают по ГОСТ 29245 (пункт 3.4).

(Поправка . ИУС N 10-2018).

7.3.2 Процедуру твердофазной экстракции осуществляют в соответствии с 7.2.1, а перерастворение и подготовку к хроматографированию - в соответствии с 7.2.2.

7.4 ВЭЖХ-МС/МС анализ

7.4.1 Для определения остаточного содержания тетрациклинов и их эпи-форм проводят анализ в условиях, указанных в 6.4.

7.4.2 Время удерживания антибиотиков тетрациклиновой группы определяют при анализе градуировочных растворов.

7.5 Контроль качества измерений

7.5.1 Каждая серия измерений включает в себя несколько степеней подтверждения качества измерений.

7.5.2 Для исключения контаминации образца используемыми реагентами проводят обработку "чистого образца" в соответствии с 7.1-7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.

7.5.3 Для учета матричного эффекта при расчете остаточных содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы используют матричную градуировку по 6.5.

7.5.4 Проводят испытание образца с обработкой пробы в соответствии 7.1-7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.

7.6 Обработка результатов хроматографического анализа

7.6.1 Расчеты содержания антибиотика тетрациклиновой группы выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров поставляемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем, для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием (приложение Б).

7.6.2 Окончательные результаты измерений содержания тетрациклинов округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.

8 Метрологические характеристики

8.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания тетрациклинов с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата 2, указанной в таблице 2.

Примечание - Значения относительной расширенной неопределенности, указанные в таблице 2, соответствуют границам относительной погрешности результатов измерений при 0,95.


Таблица 2 - Значения относительной расширенной неопределенности измерений (при коэффициенте охвата 2) , %, в диапазонах измерений содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы, мкг/кг

Антибиотик тетрациклиновой группы

Относительная расширенная неопределенность , %, при 0,95 и диапазоне измерений содержания тетрациклинов, мкг/кг

от 1,0 до 10,0 включ.

св. 10,0 до 100,0 включ.

св. 100,0 до 1000,0 включ.

Тетрациклин

Окситетрациклин

Доксициклин

Хлортетрациклин

9 Оформление результатов измерений

9.1 Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде формулы



- расширенная неопределенность при коэффициенте охвата 2 определения содержания -го антибиотика тетрациклиновой группы, определяемая по формуле (2), мкг/кг.

9.2 Значения расширенной неопределенности измерения рассчитывают с использованием значений относительной расширенной неопределенности при 2 (в соответствии с таблицей 2) по формуле

где - среднеарифметическое значение двух параллельных измерений содержания -го антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг;

- значение относительной расширенной неопределенности содержания -го антибиотика тетрациклиновой группы для соответствующего диапазона измерений (таблица 2).

10 Контроль качества результатов измерений

10.1 Контроль полноты извлечения внутреннего стандарта тетрациклинов

10.1.1 Контроль извлечения внутреннего стандарта тетрациклинов выполняют в ходе каждого измерения (получения результата количественного химического анализа при соблюдении требований настоящего стандарта).

10.1.2 Рассчитанные программным обеспечением значения извлечения внутренних стандартов должны находиться в диапазоне от 40% до 130%. Если рассчитанное значение извлечения ниже или выше указанного диапазона, то результаты измерения массовой доли тетрациклинов не принимают за окончательный результат. Проводят повторные исследования анализируемых проб.

10.2 Контроль неопределенности результатов измерений

При проведении испытаний рекомендуется в ходе анализа каждой серии образцов с использованием стандартной процедуры пробоподготовки (см. 7.1 и 7.3) проводить анализ градуировочных растворов в соответствии с 6.4. Результаты измерений признают удовлетворительными при выполнении следующего неравенства:

где - рассчитанное с помощью градуировочной характеристики значение содержания -го антибиотика тетрациклиновой группы в анализируемой пробе, мкг/кг;

- значение содержания -го антибиотика по паспорту на стандартный образец, мкг/кг;

- значение относительной расширенной неопределенности содержания -го антибиотика тетрациклиновой группы для соответствующего диапазона измерений (таблица 2), %.

Приложение А (справочное). Структурные формулы антибиотиков тетрациклинового ряда

Приложение А
(справочное)

Приложение Б (справочное). Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта

Приложение Б
(справочное)

Рисунок Б.1 - Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта

Приложение В (обязательное). Контроль стабильности результатов измерений

Приложение В
(обязательное)

Периодичность контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории*.

________________

* Документ не приводится. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке . - Примечание изготовителя базы данных.


Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности рутинного анализа с изменяющимися факторами "время" и "оператор".

Применяя метод контрольных карт Шухарта, проверяют стабильность этих результатов измерений и оценивают стандартное отклонение промежуточной прецизионности с изменяющимися факторами "время" и "оператор". После отбора испытуемую пробу от каждой партии подготавливают в лаборатории для анализа. Одну пробу, подвергавшуюся анализу во время смены (), анализирует повторно другой оператор в другую смену (), и результаты сравнивают. Значение стандартного отклонения промежуточной прецизионности () устанавливают в лаборатории по результатам измерений за предыдущий период. Параметры контрольной карты пределов для каждого диапазона рассчитывают следующим образом:

- среднюю линию по формуле

где - среднеквадратическое отклонение промежуточной прецизионности, %;

- верхний предел действия по формуле

Верхний предел предупреждения по формуле

Расхождение () рассчитывают по формуле

Расхождение наносят на карту в течение контролируемого периода.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30. После этого проводят оценку стандартного отклонения промежуточной прецизионности () результатов по формуле

где - число измерений.

Полученное значение используют для последующего контроля стабильности результатов измерений.

Библиография

Пипетки переменного объема одноканальные, Transferpettor Brand, Германия

Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см, Corning 430790 и 430290

Фильтры мембранные с размером пор 0,5 мкм, Acrodisc CR 13 мм, 0,2 мкм, Life Sciences PN 4423T

Измельчитель-гомогенизатор лабораторный МMR 0801/01, Bosch, Германия

Вибрационный встряхиватель для пробирок (вортекс) Multi Reax, Heidolph, Германия

Центрифуга лабораторная роторная рефрижераторная, Beckman, Германия

Термостатируемый нагревательный модуль с системой отдувки растворителей инертным газом, Reacti-Therm (Pierce, США)

Ультразвуковая баня, Elma S 30 Н, Германия

Стандартный образец тетрациклина гидрохлорида, USP, Sigma, T4062

Стандартный образец окситетрациклина гидрохлорида, USP, Sigma, O5875

Стандартный образец хлортетрациклина гидрохлорида, USP, Sigma, C4881

Стандартный образец доксициклина, USP, Sigma, D9891

Стандартный образец демеклоциклина, USP, Sigma, D6140

ИСО 17604:2003

Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Отбор проб с туши для микробиологического анализа (Microbiology of food and animal feeding stuffs. Carcass sampling for microbiological analysis)

УДК 637,638:614.3:006.354

Ключевые слова: пищевые продукты, продовольственное сырье, антибиотики тетрациклиновой группы, метод определения содержания с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием



Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2013

Редакция документа с учетом
изменений и дополнений подготовлена
АО "Кодекс"

ГОСТ 31694-2012. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Название документа: